世界看热讯：科研用GST标记蛋白质微量纯化试剂盒的使用方法

GST标记蛋白质微量纯化试剂盒是实验中比较常用的一款试剂盒，该试剂盒的使用方法如下：

(资料图)

一:重组蛋白的表达和细菌收集

1.37振荡培养20mL含表达质粒的细菌到OD600=0.6-0.8。

2.加IPTG到终浓度为0.1mM，30振荡培养3小时或22振荡培养8小时（或过夜）。

3.45000g离心10分钟收集20mL表达菌液，弃上清。

4.用1PBS缓冲液重悬细菌沉淀，45000g离心10分钟，弃上清。沉淀可直接用于裂解或放-80保存。1PBS缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供的10PBS缓冲液而得。PBS缓冲液极其容易长细菌，注意防止污染。

二：细胞裂解

5.如果用超声波破碎细胞，先用1 mL冰浴的新鲜配制的细胞裂解液重悬细菌沉淀（细胞裂解液的配制方法：在1 mL 1PBS缓冲液中加入50 uL溶液A和50uL 10 mg/mL的PMSF溶液，混匀即可）。冰上超声裂解重悬菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，一般选1K-10K频率处理15次，每次20秒，间隔1分钟（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否则会堵塞层析柱。

6.如果用酶法破裂细胞，则在1mL冰浴的、新鲜配制的细胞裂解液重悬细菌（细胞裂解液配制方法：在1mL 1PBS缓冲液中加入1.5mg溶菌酶干粉、50uL 10 mg/mL的PMSF溶液和5uL Benzonase溶液，混匀即可）。将重悬细菌冰上放置30分钟，得到细菌裂解物。

7.将超声或酶法得到的细胞裂解物在13000g 4离心10分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性GST标记蛋白。预留少量（如100uL）作为裂解液留样，其余用于第10步的过柱。

三：层析柱的制备和GST蛋白纯化

8.摇晃将4mL谷胱甘肽-琼脂糖介质充分混匀后，全部加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质的最低用量需要根据GST蛋白产量决定，100mL菌液最少需要使用200uL介质。此处加2mL则绰绰有余）。下列步骤各溶液的用量均针对4mL介质而定，如果介质用量不同，各溶液用量需相应调整。

9.用40mL预冷的1PBS缓冲液洗柱。

10.将第7步得到的上清液（含可溶性GST标记蛋白）上柱，让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于SDS-PAGE电泳。GST和谷胱甘肽之间的结合很缓慢，所以流速一定不能快，否则结合不充分。流速一般在0.2-1mL/分钟即可。如要提高GST标记蛋白与介质的结合效率，可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4结合30分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。

11.用10mL1PBS缓冲液洗柱，收集并保存穿透液（含杂蛋白）并预留100uL作为穿透液留样，其余在确认实验成功后再丢弃。

12.用0.2-0.5mL GST洗脱液洗柱，收集并保存穿透液，此穿透液即纯化的GST标记蛋白样品。GST洗脱液的配制方法是将约80mg GST洗脱液成分二干粉全部加入到GST洗脱液成分一溶液中，摇晃直到干粉全部溶解即得GST洗脱液，分装成小份放-20保存，每次用一管。由于它可能含蛋白酶污染，所以纯化样品不能在4长期放置，需留100uL左右用于后续浓度测定或/和SDS-PAGE电泳，其余放-80长期放置。

13.用裂解液留样（第7步）、穿透液留样（第11步）和纯化样品留样（第12步）进行蛋白定量或/和SDS-PAGE分析。注意：本操作没有预先脱盐，故只能用Bradford法或OD检测法测定裂解液留样、穿透液留样和样品留样的蛋白浓度。按OD检测法，1 OD280约等于0.5 mg/mL蛋白。由于GST的分子量为26KD，所以在SDS-PAGE胶上，GST标记蛋白将比天然蛋白大26KD。

附：GST柱的恢复（本试剂盒不含所需试剂）

1.用3倍介质体积的6M盐酸胍处理柱子10分钟。介质为2mL则用6mL，下同。

2.用3倍介质体积的超纯水处理柱子10分钟。

3.用3倍介质体积的缓冲液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）处理柱子10分钟。

4.用3倍介质体积的缓冲液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）处理柱子10分钟。

5.再重复3-4步两次。

6.用3倍介质体积的超纯水处理柱子3次。

7.若需要立即使用，则用3倍介质体积的1PBS缓冲液处理柱子2次。堵上漏口，加3倍介质体积的1PBS缓冲液洗涤后立即使用。

若长时间不用，则上步的1PBS改成20%的乙醇，其余操作完全相同。

疑难解答

Q：为何GST蛋白不与介质结合或结合很弱？

A：可能原因及解决办法：标签蛋白变性（使用温和裂解方法）、标签蛋白聚集（补加DTT）、标记蛋白浓度太低（浓缩样品）、标记蛋白改变了GST的构型（降低结合时的温度）、结合时间太短（延长蛋白与吸附柱的结合时间）。